制御性T細胞研究の歴史について振り返る

制御性T細胞の根幹理論について再考する

最近、過去20年間の自分自身の研究の旅と、免疫学全体の歴史について、その挑戦と成果を振り返っています。今日は、私の研究方向を導き、Tockyの開発への初動力となった重要な要因について書きます。

問題との出会い

2002年に私は学内留学というかたちで京都大学皮膚科から、当時京都大学再生医科学研究所に存在した坂口志文教授の研究室で博士課程を開始します。

研究内容は制御性T細胞におけるGITRの役割についてでした。この研究を深めるため、私は、坂口志文教授グループが出版した制御性T細胞に関する論文の中で一番重要な論文のひとつであるAsano et al, J Exp Med, 1996に着目しました。

Asanoらは、マウスの出生後3日目までにCD25陽性T細胞が現れないとするデータを報告します。CD25陽性T細胞は出生後４日目以降急激に数を増やしていくというデータです。

1990年代当時、CD25というマーカーは活性化T細胞を同定するのに使われていた背景を知ると、この意味がわかってきます。

つまり、CD25陽性T細胞が「胸腺で特別に発生したCD25陽性T細胞が自己免疫病を抑えるはたらきをもつ」という理論を支える証拠として、Asanoらの報告した新生仔期間におけるCD25陽性T細胞の動態についてのデータは最も重要なものでした。これが、「制御性T細胞（Treg）という特別なT細胞が自己免疫病を抑えるはたらきをもって発生する」という、現在も流布している制御性T細胞の概念の確立につながります。

2003年、私は博士課程2年目でしたが、Asanoらのデータの再確認をする実験を行いました。そして、Asanoらの論文のデータとは異なり、出生後1日目の新生仔マウスの脾臓と胸腺に十分たくさんのCD25陽性T細が存在することに気が付きます。２日目、３日目、７日目、１週間目、２週間目、いずれも大差はありません。

2003年に新生仔マウスのT細胞を研究していた当時のノート.

この実験結果は、Asanoらの1996年のTreg画期的論文の主要な主張と明確に矛盾します。しかし何度追試しても自分のデータは揺らぎなく同じ結論を示します。

制御性T細胞の研究分野は、何かが決定的におかしいと確信しました。

再現性の確認

この発見は私だけのものではありませんでした - Dujardin et al, PNAS, 2004に出版されている、バンデイラの率いる研究グループからのデータも、私が発見した結果と同じでした。

現状

当時、私はAsanoら1996年の研究成果に大きく依存している制御性T細胞理論が間もなく改訂されると信じていました。

しかし残念ながら、それは起こりませんでした。

多くの教科書や総説論文は、新生児の制御性T細胞の動態について反証が多数あるにもかかわらず、Asanoらの発見を紹介していました。

その状況をうけて、2015年に私がAsanoらの論文の問題についての検証論文を発表することになります。これによりAsanoらの「発見」を紹介する教科書や論文の数はかなり少なくなりましたが、最近でも、たとえば雑誌ネーチャーに掲載されたSvoboda, Nature, 2022の制御性T細胞に関する記事でも、すでに時代遅れとなった、Asanoらの論文が紹介されています。

制御性T細胞研究の見直し〜境界を超えて

この経験により、制御性T細胞分野の広く受け入れられている論文や理論を厳密に検証することを私は目指します。そして、さまざまなアプローチによる研究により、Tregの理論と概念自体に大幅な見直しが必要であると確信しました。

この認識は、制御性T細胞ひいてはT細胞全体を新しい視点で研究するための新規研究方法を開発する必要性があることを理解しました。

2009年、ヒエラルキーの中から出て、自分の研究分野を拡大し、自由に研究するために、日本から英国へ移動することを決断します。

この取り組みは、その後、ゲノミクスにおける多次元方法、正準対応解析（Canonical Correspondence Analysis, CCA)とTockyの開発に結びつくことになります (Ono et al., 2013; Bending et al., 2018)。

「制御性T細胞神話」と展望

Asanoらの論文の問題は、免疫学の広い分野の発展と研究を阻害するという深刻な意味がありました。ですから私は後に、これらの効果を検証し、過去の論文からの証拠を分析し、新たな視点を提案する論文を執筆・出版しました(Ono & Tanaka, 2016)。

さらに、Asano et al, 1996の論文に由来する、「制御性T細胞がユニークで特別な細胞である」という刷り込みのために、多くの論文において研究デザインの方向性や、研究結果の解釈が歪んでしまっており、科学的真実からますます遠ざかっているのが現状と思います。

これは１細胞分析や、Foxp3についての高度な解析など、最先端技術をつかった制御性T細胞研究についても同じことです。間違ったデザインと、間違った解釈は、間違った結果につながるのみです。

結局のところ間違った論文を奉り続けることで、免疫学の発展が止まっているということです。

つまり「ユニークで特別な細胞」というこだわりを捨てて、Foxp3と制御性T細胞を分析する新しい研究の枠組みを確立することが緊急に求められています。

この問題意識が私たちのTocky論文第２弾である、Foxp3転写の時間動態解析につながります (Bending et al., 2018)。はEMBO Journalに掲載されたこの論文の内容については次の記事「制御性T細胞応用を目指した臨床試験の悲劇」で紹介します。

References

2018

A timer for analyzing temporally dynamic changes in transcription during differentiation in vivo

David Bending , Paz Prieto Martı́n , Alina Paduraru , Catherine Ducker , Erik Marzaganov , Marie Laviron , Satsuki Kitano , Hitoshi Miyachi , Tessa Crompton , and Masahiro Ono

Journal of Cell Biology, Sep 2018

The foundational publication introducing Tocky technology by the Ono lab, marking a breakthrough in T cell and B cell studies.

Abstract Publication

Understanding the mechanisms of cellular differentiation is challenging because differentiation is initiated by signaling pathways that drive temporally dynamic processes, which are difficult to analyze in vivo. We establish a new tool, Timer of cell kinetics and activity (Tocky; or toki [time in Japanese]). Tocky uses the fluorescent Timer protein, which spontaneously shifts its emission spectrum from blue to red, in combination with computer algorithms to reveal the dynamics of differentiation in vivo. Using a transcriptional target of T cell receptor (TCR) signaling, we establish Nr4a3-Tocky to follow downstream effects of TCR signaling. Nr4a3-Tocky reveals the temporal sequence of events during regulatory T cell (Treg) differentiation and shows that persistent TCR signals occur during Treg generation. Remarkably, antigen-specific T cells at the site of autoimmune inflammation also show persistent TCR signaling. In addition, by generating Foxp3-Tocky, we reveal the in vivo dynamics of demethylation of the Foxp3 gene. Thus, Tocky is a tool for cell biologists to address previously inaccessible questions by directly revealing dynamic processes in vivo.
A temporally dynamic Foxp3 autoregulatory transcriptional circuit controls the effector Treg programme

David Bending , Alina Paduraru , Catherine B Ducker , Paz Prieto Martı́n , Tessa Crompton , and Masahiro Ono

The EMBO journal, Sep 2018

The second Tocky paper from the Ono lab uncovers the temporally dynamic regulation of Foxp3 transcription, offering new insights into T cell regulation.

Abstract Publication

Regulatory T cells (Treg) are negative regulators of the immune response; however, it is poorly understood whether and how Foxp3 transcription is induced and regulated in the periphery during T‐cell responses. Using Foxp3‐Timer of cell kinetics and activity (Tocky) mice, which report real‐time Foxp3 expression, we show that the flux of new Foxp3 expressors and the rate of Foxp3 transcription are increased during inflammation. These persistent dynamics of Foxp3 transcription determine the effector Treg programme and are dependent on a Foxp3 autoregulatory transcriptional circuit. Persistent Foxp3 transcriptional activity controls the expression of coinhibitory molecules, including CTLA‐4 and effector Treg signature genes. Using RNA‐seq, we identify two groups of surface proteins based on their relationship to the temporal dynamics of Foxp3 transcription, and we show proof of principle for the manipulation of Foxp3 dynamics by immunotherapy: new Foxp3 flux is promoted by anti‐TNFRII antibody, and high‐frequency Foxp3 expressors are targeted by anti‐OX40 antibody. Collectively, our study dissects time‐dependent mechanisms behind Foxp3‐driven T‐cell regulation and establishes the Foxp3‐Tocky system as a tool to investigate the mechanisms behind T‐cell immunotherapies.

2016

Controversies concerning thymus‐derived regulatory T cells: fundamental issues and a new perspective

Masahiro Ono, and Reiko J Tanaka

Immunology and cell biology, Sep 2016

A landmark opinion piece challenging the reproducibility of a foundational Treg experiment, while introducing a groundbreaking dynamic view on Foxp3-mediated T cell regulation.

Abstract Publication

Thymus-derived regulatory T cells (Tregs) are considered to be a distinct T-cell lineage that is genetically programmed and specialised for immunosuppression. This perspective is based on the key evidence that CD25+ Tregs emigrate to neonatal spleen a few days later than other T cells and that thymectomy of 3-day-old mice depletes Tregs only, causing autoimmune diseases. Although widely believed, the evidence has never been reproduced as originally reported, and some studies indicate that Tregs exist in neonates. Thus we examine the consequences of the controversial evidence, revisit the fundamental issues of Tregs and thereby reveal the overlooked relationship of T-cell activation and Foxp3-mediated control of the T-cell system. Here we provide a new model of Tregs and Foxp3, a feedback control perspective, which views Tregs as a component of the system that controls T-cell activation, rather than as a distinct genetically programmed lineage. This perspective provides new insights into the roles of self-reactivity, T cell–antigen-presenting cell interaction and T-cell activation in Foxp3-mediated immune regulation.

2013

Visualising the cross-level relationships between pathological and physiological processes and gene expression: analyses of haematological diseases

Masahiro Ono, Reiko Tanaka , Manabu Kano , and Toshio Sugiman

PLoS One, Sep 2013

The pioneering study developing Canonical Correspondence Analysis (CCA) as a genomics method, establishing a novel approach for transcriptome analysis.

Abstract Publication

The understanding of pathological processes is based on the comparison between physiological and pathological conditions, and transcriptomic analysis has been extensively applied to various diseases for this purpose. However, the way in which the transcriptomic data of pathological cells relate to the transcriptomes of normal cellular counterparts has not been fully explored, and may provide new and unbiased insights into the mechanisms of these diseases. To achieve this, it is necessary to develop a method to simultaneously analyse components across different levels, namely genes, normal cells, and diseases. Here we propose a multidimensional method that visualises the cross-level relationships between these components at three different levels based on transcriptomic data of physiological and pathological processes, by adapting Canonical Correspondence Analysis, which was developed in ecology and sociology, to microarray data (CCA on Microarray data, CCAM). Using CCAM, we have analysed transcriptomes of haematological disorders and those of normal haematopoietic cell differentiation. First, by analysing leukaemia data, CCAM successfully visualised known relationships between leukaemia subtypes and cellular differentiation, and their characteristic genes, which confirmed the relevance of CCAM. Next, by analysing transcriptomes of myelodysplastic syndromes (MDS), we have shown that CCAM was effective in both generating and testing hypotheses. CCAM showed that among MDS patients, high-risk patients had transcriptomes that were more similar to those of both haematopoietic stem cells (HSC) and megakaryocyte-erythroid progenitors (MEP) than low-risk patients, and provided a prognostic model. Collectively, CCAM reveals hidden relationships between pathological and physiological processes and gene expression, providing meaningful clinical insights into haematological diseases, and these could not be revealed by other univariate and multivariate methods. Furthermore, CCAM was effective in identifying candidate genes that are correlated with cellular phenotypes of interest. We expect that CCAM will benefit a wide range of medical fields.