制御性T細胞という教義の呪いからデータによる免疫学へ（２）

何が免疫学の進歩をとどめているのか。何が未来のために必要なのか。

「データによる免疫学」への私自身の研究の旅

正準対応分析(CCA)による突破口

「データによる免疫学」を追い求めた、過去17年間の私自身の研究の旅に戻りたいと思います。

2008年に私が直面した21世紀の免疫学の重要な問題を認識して以来、私は従来のストーリー駆動型のアプローチから脱却することを目指しました。それは、「権威ある雑誌」（いわゆるトップランク雑誌、Nature, Cell Scienceなどで代表されるもの）に多々あるようなストーリー指向型免疫学の論文を目指すのではなく、データ駆動型の科学としての免疫学の確立を目指しました。

2007年に自分自身でNatureに論文を発表した後も、トップランクの雑誌の価値に納得できませんでした。なぜなら私は本当に重要であるのはデータとその適切な分析だけだからです。

このため、私は日本を離れ、2009年から2013年の間、ヒューマンフロンティアサイエンスプログラムのフェローシップにより、免疫学的ゲノム分析の新しい方法論を探求・開発することに専念することにしました。

幸運にも、ロンドンで私の受け入れ研究者であったユニバーシティカレッジロンドン (UCL) の故ロビン・キャラード教授はとても理解が深く支援的でした。ロビンのおかげで、この3年間、私は完全に自由に自分自身の考えだけで研究に専念できました。

この３年間のあいだのブレークスルーは、正準対応分析（CCA）をゲノムデータ解析に適応できた時に起こりました。これにより、遺伝子発現プロファイルの勾配に関連してプロトタイプ細胞の表現型を比較することで、特徴づけられていない細胞の表現型を定量的に分析する多次元的な方法が確立されました。

生態学者の方がこの文章を読まれていたならば、このアプローチは、イオン濃度に関連して海洋の場所に応じた魚種分布を分析するter Braakの分析と相同なものであることがきっとわかってくれると思います。

静かな研究室でのTockyの開発

創造性を完全に発揮するためには静かな場所が重要です。

正準対応分析をつかったゲノム解析で得たコンピューターのスキルをつかって、2013年には新しい実験方法論を創出するための技術革新を開始しました。これには、既知の動力学で自発的に発光スペクトルを変化させる蛍光タイマー蛋白質 (Fluorescent Timer protein) を使用することが含まれています。これにより、T細胞活動の時間動態を分析することができます。

この方法論 - Tocky (とき) - の詳細についてはまた改めて書きますが、まずは2018年の記事を参照ください。

人と話さない、論文を読まない、Google検索をしない、という決まりについて

幸いなことに、2013年に私は大きな独立用グラントを取得できました（BBSRC David Phillipsフェローシップ）。これにより自分自身の研究室を立ち上げ、全く新しいものを創りだす機会が得られたのです。この研究は、実験およびコンピューターによる分析方法を統合することが一つの課題でした。

私は研究室を立ち上げましたが、その最初の月をどう過ごすかについて決まりを作りました。「他の人と話さない、論文を読まない、Google検索をはじめネットの検索を一切行わない」というものです。そして、自分自身の頭の中だけで、個々のT細胞の運命を明らかにできる新しいアプローチの設計と改良に専念することにしました。

このような方法が開発されれば、個々のT細胞がどのようにしてその表現型（系統）をダイナミックに変化させるかを理解することができるでしょう。これは、体内で起こり得ると私が信じている出来事です。

Tockyへの道はCCAを経由する

そしてCCAを使用して、T細胞受容体（TCR）シグナリングの下流に位置するNr4a3という遺伝子を同定しました。Nr4a3蛍光タイマーレポーターが開発されれば、個々のT細胞内のTCRシグナリング活動の時間的ダイナミクスを定量的に測定することができるでしょう。

さらに、Foxp3蛍光タイマーレポーターは、Asanoらの論文にみられる再現不可能なデータに由来する制御性T細胞の生物学に関する根本的な疑問に対処するべきです。

幸い私は分子生物学に完全に習熟しており、効率的にトランスジェニックレポーター構築を開発することができました。これは2006年から2009年までの間に京都、日本でバクテリア人工染色体の使用技術を身につけたおかげです。当時の京大での研究費が免疫抑制剤の開発をめざす産学連携の予算であったため、私が開発したノックアウト動物は論文公表されることはありませんでしたが。

しかし、2013年のロンドンでは、これらの分子生物学技術をフルに活用して、迅速に2つのタイマーレポーターライン（現在はNr4a3-TockyとFoxp3-Tockyとして知られています）を開発できました。

そして、この分子生物学プロジェクトをできるだけ効果的に行うため、ポスドクを採用することはせず、１年間は自分自身がポスドクとしてラボで働くと心に決めます。

このようにして、2013年は、私の研究生活で最も生産的なやりかたで過ごされました。

もし、あなたが新しくラボをもつようになった研究者で、ボスも部下もなく自分だけで研究をしたことがない場合、自分の創造性のためだけに自分自身の時間を使う素晴らしい機会を逃してはいけません。少なくともイギリスでは、そのような時間は二度と来ないかもしれませんから。

実験的方法とデータ解析方法の統合としてのTockyについて

フェローシップ開始から1年以上後の2014年、新しいTockyマウスが誕生した後、私はついにテクニシャンを募集し始めました。彼女は勤勉な労働者であり、一緒に誕生したてのTockyマウスの分析を始めました。

そして私は大事なことに気づきました。Tockyの研究は実験だけでは十分ではないということです。Tockyマウスによって得られるデータを十分に分析して理解するためには、専用のデータ解析方法論を開発する必要がありました。

結局、このデータ解析方法論の開発への旅は予想以上に長くなりました。今、2025年、つまりTockyマウスを報告した最初の論文(Bending et al., 2018; Bending et al., 2018)から7年、 Tockyの開発を始めてから12年後、ついにデータ解析論部分が完全に開発され、立ち上げの準備が整ったと言えるところまで来たと思います。

いくつか発表ずみの論文を紹介してこの記事を終わります(Ono, 2024; Ono & Crompton, 2024; Ono, 2024; Ono, 2025)。

References

2025

TockyPrep: data preprocessing methods for flow cytometric fluorescent timer analysis

Masahiro Ono

Nov 2025

Abstract Publication

Fluorescent Timer proteins, which display time-dependent changes in their emission spectra, are invaluable for analyzing the temporal dynamics of cellular events at the single-cell level. We previously developed the Timer-of-cell-kinetics-and-activity (Tocky) tools, utilizing a specific Timer protein, Fast-FT, to monitor temporal changes in cellular activities. Despite their potential, the analysis of Timer fluorescence in flow cytometry is frequently compromised by variability in instrument settings and the absence of standardized preprocessing methods. The development and implementation of effective data preprocessing methods remain to be achieved.

2024

TockyPrep: Data Preprocessing Methods for Flow Cytometric Fluorescent Timer Analysis

Masahiro Ono

Nov 2024

Abstract Publication

Background: Fluorescent Timer proteins, which display time-dependent changes in their emission spectra, are invaluable for analyzing the temporal dynamics of cellular events at the single-cell level. We previously developed the Timer-of-cell-kinetics-and-activity (Tocky) tools, utilizing a specific Timer protein, Fast-FT, to monitor temporal changes in cellular activities. Despite their potential, the analysis of Timer fluorescence in flow cytometry is frequently compromised by variability in instrument settings and the absence of standardized preprocessing methods. The development and implementation of effective data preprocessing methods remain to be achieved. Results: In this study, we introduce the R package that automates the data preprocessing of Timer fluorescence data from flow cytometry experiments for quantitative analysis at single-cell level. Our aim is to standardize Timer data analysis to enhance reproducibility and accuracy across different experimental setups. The package includes a trigonometric transformation method to elucidate the dynamics of Fluorescent Timer proteins. We have identified the normalization of immature and mature Timer fluorescence data as essential for robust analysis, clarifying how this normalization affects the analysis of Timer maturation. These preprocessing methods are all encapsulated within the TockyPrep R package. Conclusions: TockyPrep is available for distribution via GitHub at this https URL, providing tools for data preprocessing and basic visualization of Timer fluorescence data. This toolkit is expected to enhance the utility of experimental systems utilizing Fluorescent Timer proteins, including the Tocky tools.
A multidimensional toolkit for elucidating temporal trajectories in cell development in vivo

Masahiro Ono, and Tessa Crompton

Development, Nov 2024

Abstract Publication

Progenitor cells initiate development upon receiving key signals, dynamically altering gene and protein expression to diverge into various lineages and fates. Despite the use of several experimental approaches, including the Fluorescent Timer-based method Timer-of-cell-kinetics-and-activity (Tocky), analysing time-dependent processes at the single-cell level in vivo remains challenging. This study introduces a novel integrated experimental and computational approach, using an advanced multidimensional toolkit. This toolkit facilitates the simultaneous examination of temporal progression and T-cell profiles using high-dimensional flow cytometric data. Employing novel algorithms based on Canonical Correspondence Analysis (CCA) and network analysis, our toolkit identifies developmental trajectories and analyses dynamic changes in developing cells. The efficacy of this approach is demonstrated through analysing thymic T-cells from Nr4a3-Tocky mice, which monitor activities downstream of the T-cell receptor (TCR) signal. Further validation was achieved by deleting the proapoptotic gene Bcl2l11 (Bim) in Nr4a3-Tocky mice. This revealed dynamic changes in thymic T-cells during cellular development and negative selection following TCR signalling. Overall, this study establishes a new method for analysing the temporal dynamics of individual developing cells in response to in vivo signalling cues.
TockyLocus: Quantitative Analysis Methods for Flow Cytometric Fluorescent Timer Data

Masahiro Ono

Nov 2024

Abstract Publication

Fluorescent Timer proteins, which spontaneously change their emission spectra over time, are valuable tools for analyzing temporal changes in cellular activities at the single-cell level. Traditional analysis of Fluorescent Timer data has mostly relied on conventional flow cytometric methods, which lacks the sophistication needed for detailed quantitative analysis. Recently, we developed the Timer-of-Cell-Kinetics-and-Activity (Tocky) tools, employing transgenic reporter systems using an mCherry mutant Timer protein, Fast-FT, to analyze these changes, implementing data preprocessing methods for Timer fluorescence. Despite this advancement, the computational implementation of effective quantitative analysis methods for Fluorescent Timer data has been lacking. In this study, we introduce rigorous algorithms for a data categorization method, designated as the Tocky locus approach, which uses normalized and trigonometric-transformed Fluorescent Timer data, suitable for quantitative analysis. We found that the five-locus approach, which categorizes Timer fluorescence into five categories, optimally captures the dynamics of Timer profiles, thus enabling effective quantitative statistical analysis and biological interpretation. The current study has developed comprehensive tools for data categorization, visualization, and statistical analysis optimized to Tocky Locus data. These algorithms have been implemented in the TockyLocus package, a new R package designed to facilitate the quantitative analysis of Timer fluorescence data. This toolkit is expected to significantly enhance the utility of experimental systems using Fluorescent Timer proteins, particularly the Tocky tools, by standardizing methods for analyzing dynamic cellular events and responses.

2018

A timer for analyzing temporally dynamic changes in transcription during differentiation in vivo

David Bending , Paz Prieto Martı́n , Alina Paduraru , Catherine Ducker , Erik Marzaganov , Marie Laviron , Satsuki Kitano , Hitoshi Miyachi , Tessa Crompton , and Masahiro Ono

Journal of Cell Biology, Nov 2018

The foundational publication introducing Tocky technology by the Ono lab, marking a breakthrough in T cell and B cell studies.

Abstract Publication

Understanding the mechanisms of cellular differentiation is challenging because differentiation is initiated by signaling pathways that drive temporally dynamic processes, which are difficult to analyze in vivo. We establish a new tool, Timer of cell kinetics and activity (Tocky; or toki [time in Japanese]). Tocky uses the fluorescent Timer protein, which spontaneously shifts its emission spectrum from blue to red, in combination with computer algorithms to reveal the dynamics of differentiation in vivo. Using a transcriptional target of T cell receptor (TCR) signaling, we establish Nr4a3-Tocky to follow downstream effects of TCR signaling. Nr4a3-Tocky reveals the temporal sequence of events during regulatory T cell (Treg) differentiation and shows that persistent TCR signals occur during Treg generation. Remarkably, antigen-specific T cells at the site of autoimmune inflammation also show persistent TCR signaling. In addition, by generating Foxp3-Tocky, we reveal the in vivo dynamics of demethylation of the Foxp3 gene. Thus, Tocky is a tool for cell biologists to address previously inaccessible questions by directly revealing dynamic processes in vivo.
A temporally dynamic Foxp3 autoregulatory transcriptional circuit controls the effector Treg programme

David Bending , Alina Paduraru , Catherine B Ducker , Paz Prieto Martı́n , Tessa Crompton , and Masahiro Ono

The EMBO journal, Nov 2018

The second Tocky paper from the Ono lab uncovers the temporally dynamic regulation of Foxp3 transcription, offering new insights into T cell regulation.

Abstract Publication

Regulatory T cells (Treg) are negative regulators of the immune response; however, it is poorly understood whether and how Foxp3 transcription is induced and regulated in the periphery during T‐cell responses. Using Foxp3‐Timer of cell kinetics and activity (Tocky) mice, which report real‐time Foxp3 expression, we show that the flux of new Foxp3 expressors and the rate of Foxp3 transcription are increased during inflammation. These persistent dynamics of Foxp3 transcription determine the effector Treg programme and are dependent on a Foxp3 autoregulatory transcriptional circuit. Persistent Foxp3 transcriptional activity controls the expression of coinhibitory molecules, including CTLA‐4 and effector Treg signature genes. Using RNA‐seq, we identify two groups of surface proteins based on their relationship to the temporal dynamics of Foxp3 transcription, and we show proof of principle for the manipulation of Foxp3 dynamics by immunotherapy: new Foxp3 flux is promoted by anti‐TNFRII antibody, and high‐frequency Foxp3 expressors are targeted by anti‐OX40 antibody. Collectively, our study dissects time‐dependent mechanisms behind Foxp3‐driven T‐cell regulation and establishes the Foxp3‐Tocky system as a tool to investigate the mechanisms behind T‐cell immunotherapies.